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    奧林巴斯顯微鏡BX53的觀察方式

    簡要描述:奧林巴斯顯微鏡BX53的觀察方式



    奧林巴斯生物顯微鏡BX53布局靈活,拓展性強(qiáng),這均得益于BX563所采用的很好的的模塊化設(shè)計,除了集成的明場觀察部件外,還能添加各種其他的模塊化部件,如熒光、相差、偏光、暗場等,很好的拓展性可以應(yīng)對各種需求。

    • 產(chǎn)品型號:
    • 廠商性質(zhì):經(jīng)銷商
    • 更新時間:2023-10-20
    • 訪  問  量:2157

    詳細(xì)介紹

    品牌OLYMPUS/奧林巴斯產(chǎn)地類別進(jìn)口
    應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,電子/電池

    奧林巴斯顯微鏡BX53的觀察方式

    明場觀察

    通常所說的明場,指的是由顯微鏡光源的照明光經(jīng)過聚光鏡匯聚照射到標(biāo)本上,被標(biāo)本吸收后,剩余的光進(jìn)入物鏡,然后通過目鏡被人眼看到或者被通過C接口被攝像頭拍到。照明光路采用科勒照明或臨界點照明。

    血涂片、革蘭氏染色的細(xì)菌涂片、染色的病理切片、植物的切片、骨磨片等都采用明場方式觀察。這幾類標(biāo)本比較適合用正置顯微鏡觀察,與倒置顯微鏡相比,正置顯微鏡的聚光鏡可以離標(biāo)本很近,數(shù)值孔徑比較大,所以整體的分辨率要比倒置鏡高,看標(biāo)本更清楚。

    明場觀察的要求主要是結(jié)構(gòu)清晰、顏色準(zhǔn)確,如何保證清晰準(zhǔn)確呢?

    首先是制片,為了盡可能的看到清晰的結(jié)構(gòu),我們先注意一下標(biāo)本制備中要不要封片以及如何封片的問題,因為不同的物鏡對標(biāo)本封片與否的要求是不一樣的。

    如下圖中的三個物鏡,參數(shù)中的“0.17"表示在該物鏡下觀察的標(biāo)本需要用厚度為0.17mm的蓋玻片封片;參數(shù)“0"表示在該物鏡下觀察的標(biāo)本不能用蓋玻片封片,適合各種涂片或磨片;參數(shù)“-"表示該物鏡對封片與否沒有要求,封片或不封片的標(biāo)本都可以觀察。

    圖1 光學(xué)顯微鏡中物鏡上的重要參數(shù)

    對于需要封片的標(biāo)本,標(biāo)本要浸沒在封片劑中,再蓋上蓋玻片,不可以不加封片劑直接蓋蓋玻片。封片劑的折射率一般與標(biāo)本接近,盡量減少成像光路中折射率的突兀變化,以保證最佳通透性。生物組織的折射率一般在1.3~1.5之間,蓋玻片的玻璃折射率為1.52左右,油鏡的油折射率為1.518,所以封片劑的折射率一般不超過1.518。

    圖2 光學(xué)顯微鏡制片示意圖

    其次是顯微鏡組件參數(shù),數(shù)值孔徑(NA)是物鏡和聚光鏡的固有參數(shù),物鏡的數(shù)值孔徑(NA)越大分辨率越高,看到的標(biāo)本就越清楚。同樣,聚光鏡的數(shù)值孔徑越大分辨率越高。所以選擇數(shù)值孔徑比較大的物鏡和聚光鏡有助于看清更多的標(biāo)本細(xì)節(jié)孔徑光闌(Aperture)位于聚光鏡上,孔徑數(shù)值可調(diào),也影響分辨率,孔徑數(shù)值越大顯微鏡成像分辨率越高。

    圖3 孔徑光闌

    注意:物鏡和聚光鏡的數(shù)值孔徑越大,其工作距離(或者理解為焦距)越短。孔徑光闌數(shù)值越大,顯微鏡成像的對比度越低,景深越小。

    另外,照明光源的色溫會影響到顯色效果。同一個標(biāo)本,照明色溫比較低時,標(biāo)本中的紅色就比較鮮艷,藍(lán)色比較暗;相反色溫偏越高時,標(biāo)本中藍(lán)色就越鮮艷紅色越暗。

    顯微鏡常用作明場照明的光源有兩種:鹵素?zé)艉蚅ED燈。

    鹵素?zé)舻恼w色溫比較低,看起來明顯偏黃色,一般會在照明光路里加一個日光濾片提高色溫,使標(biāo)本的顏色更均衡。然而鹵素?zé)舻纳珳貢S著燈的亮度而變化,燈調(diào)節(jié)的越亮,色溫越高。我們知道在使用顯微鏡從低倍物鏡轉(zhuǎn)換到高倍物鏡時,需要調(diào)亮照明光來保證目鏡觀察到的視野亮度一致,這樣就會導(dǎo)致色溫升高,從而使得高倍鏡看到的標(biāo)本中藍(lán)色結(jié)構(gòu)比低倍鏡中更鮮艷,而低倍鏡中看到的紅色結(jié)構(gòu)更鮮艷。要解決這個色彩偏差,方法有:

    基礎(chǔ)的顯微鏡可以配置恒定亮度的物鏡組,低倍鏡跟高倍鏡的亮度一樣,這樣就不需要調(diào)整燈的亮度。

    高級的全自動顯微鏡使用恒定色溫轉(zhuǎn)輪,根據(jù)不同物鏡自動調(diào)整鹵素?zé)袅炼炔⒆詣诱{(diào)節(jié)色溫轉(zhuǎn)輪,來使最終的照明色溫保持恒定。

    使用恒定色溫的照明光源:LED燈。

    LED燈的色溫恒定,不會隨亮度變化。顯微鏡明場照明用的LED燈通常色溫恒定在5000K,接近太陽光的平均色溫。

    最后使用顯微鏡配備的攝像頭拍照時,如果發(fā)現(xiàn)電腦屏幕上呈現(xiàn)的圖像偏色,就需要先做一下白平衡

    圖4 選取視野中的空白區(qū)域作為參照進(jìn)行白平衡

    顏色的鮮艷程度則可以通過色飽和度調(diào)節(jié),飽和度越高,圖像色彩越艷麗,飽和度時,圖像就失去色彩呈現(xiàn)為黑白色。

    需要注意的是,不必要求屏幕上顯示的標(biāo)本顏色跟目鏡里看到的*一致,因為任何顯示器所能顯示的顏色都是有限的,如下圖所示,在Lab色域圖中,舌頭形狀的區(qū)域為人眼所能看到的顏色,專業(yè)的顯示器執(zhí)行Adobe RGB標(biāo)準(zhǔn),所能呈現(xiàn)的顏色為黑色虛線三角形內(nèi)的區(qū)域,一般的顯示器執(zhí)行sRGB標(biāo)準(zhǔn),能呈現(xiàn)的顏色就更少了。

    圖5 人眼與不同顯示器觀察到的色域不同

    相差成像

    檢查培養(yǎng)中的活細(xì)胞的生長狀態(tài)時,常用相差方法觀察。因為活細(xì)胞一般不染色,細(xì)胞比較透明,直接用明場觀察的話不容易看清楚,用相差方式可以提高反差(下圖),更容易看清細(xì)胞狀態(tài)。

    圖6 活細(xì)胞觀察對比

    顯微鏡要實現(xiàn)相差效果需要兩個條件:相差物鏡和相差環(huán),觀察時需要選擇相差物鏡并將對應(yīng)的相差環(huán)移入光路。相差物鏡上會有標(biāo)志“PH0"、“PH1"、“PH2"等,數(shù)字表示對應(yīng)的相差環(huán)型號,另外相差環(huán)上也會明確標(biāo)注對應(yīng)的物鏡倍數(shù),使用相差時一定要保證物鏡和相差環(huán)正確匹配。

    圖7 相差成像設(shè)備圖解

    暗場成像

    實際是暗場照明法。不直接觀察到照明的光線,而觀察到的是被物體反射或散射的光線,暗背景,樣品閃亮(下圖)。適合觀察微小水生生物、纖維、毛發(fā)、細(xì)菌,以及進(jìn)行尿檢等。

    圖8 明暗成像對比

    圖9 暗場成像下的小水生生物

    暗場觀察所需要的特殊附件是暗場環(huán)和聚光鏡,聚光鏡的數(shù)值孔徑至少比所用物鏡大0.2才可以實現(xiàn)較好的暗場效果。

    圖10 暗場成像原理

    微分干涉(DIC)成像

    如果細(xì)胞標(biāo)記了熒光,就不太適合再用相差物鏡觀察了,因為相差物鏡內(nèi)有相位環(huán),會阻擋部分熒光,此時比較適合的反差增強(qiáng)方法是DIC。DIC可以用高透光的復(fù)消色差物鏡搭配DIC棱鏡和偏光片來實現(xiàn),拍攝熒光時DIC組件可以從光路中移除,不會對熒光成像產(chǎn)生影響。

    DIC呈現(xiàn)出漂亮的3D圖像(非真實三維圖像),無光暈,分辨率大于相差,適合搭配熒光,但是不適合在塑料器皿中成像。

    圖11 DIC下的細(xì)胞成像

    DIC成像時需要在光路中移入4個組件,相對比較復(fù)雜,所以一般配在全自動顯微鏡上,由顯微鏡自動控制各個組件,以方便使用者操作。并可實現(xiàn)長時間定時拍攝,記錄動態(tài)過程。

    整合調(diào)制反差(IMC)成像

    顯微操作時,需要標(biāo)本呈現(xiàn)出一定的立體效果,DIC雖然有立體效果,但是用DIC時不能用塑料器皿,而顯微操作多數(shù)都是在塑料器皿里進(jìn)行的。整合調(diào)制反差(IMC)或者霍夫曼反差(HMC)正好滿足這個需求。

    IMC或者HMC是一種斜照明效果,一側(cè)的狹縫照明造成陰影,產(chǎn)生立體效果。可用于塑料器皿內(nèi)標(biāo)本的顯微操作。

    圖12 IMC成像適用于顯微操作

    HMC需要專用的物鏡搭配聚光鏡上的調(diào)制器,專用物鏡對熒光有一定的阻擋。IMC無需專用物鏡,可用普通物鏡搭配調(diào)制器實現(xiàn),對熒光成像沒有影響。


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